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乙型肝炎病毒核酸荧光定量检测及YMDD变异检测试剂盒(HBV&YMDD)

更新:2013-7-5 16:50:49      点击:
  • 品牌:   夸克
  • 型号:   
产品介绍

【药品名称】
乙型肝炎病毒核酸荧光定量检测及YMDD变异检测试剂盒
【汉语拼音】
yixingganyan bingdu hesuan yingguang dingliangjiance ji YMDD bianyi jiance shijihe
【使用目的和试验原理】
本品系采用乙型肝炎病毒特异引物,利用核酸扩增、荧光标记探针,结合Taqman MGB双探针技术,对人血清或血浆中乙型肝炎病毒核酸(HBV DNA)定量检测,同时对YMDD M位点变异进行检测。可用于临床对乙型肝炎的辅助诊断和抗病毒药物的疗效观察。
【适用仪器】
本试剂盒适用于ABI7000、MJ-II、ABI7900型荧光定量PCR仪及相应软件。
【标本要求】
用一次性的针筒抽取病人静脉血2ml,置于灭菌的一次性非肝素抗凝试管中,取分离出的血清0.2ml送检。血清标本在2℃~8℃可放置72小时,-70℃可长期保存,标本不宜反复冻融。
【试验方法】
标本、对照品的处理和加样
血清标本、试剂盒内阳性对照、阴性对照、YVDD对照、YIDD对照各取50μl(冻存血清或对照品使用前在室温融解,振荡混匀10秒钟),分别加入50μl核酸提取液,振荡10秒,99℃干浴或水浴10分钟,13000rpm离心10分钟,保留上清备用。处理后的样品应在3小时内使用,或在-20℃~-80℃最长保存1个月(不宜反复冻融)。
HBV DNA标准品进行10、100、1000倍梯度稀释。
取N×36μl混合液与N×0.4μl酶(Taq+UNG)混匀(N为反应管数),3000rpm离心10秒,取36.4μl上述PCR反应混合液于适当容量离心管中,然后将样品、阳性对照、阴性对照、YVDD对照、YIDD对照处理上清液和梯度稀释的HBV DNA标准品各4μl分别加入离心管中,立即进行PCR扩增反应。
PCR扩增
离心管置于定量荧光PCR仪上,ABI7000、MJ-II、ABI7900循环参数设置:
37℃×2min;94℃×2min;再按93℃×15sec→60℃×60sec,循环40次;荧光检测在60℃,反应体系为40μl。
荧光通道检测选择:HBV DNA定量检测选用FAM通道,YMDD变异检测选用VIC通道。
将定量标准品及各稀释度拷贝数浓度输入仪器软件中。
【结果分析】
质量控制
进行定量分析,选择荧光检测模式FAM荧光,基线调整取5-15个循环的荧光信号,阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点。阴性对照HBV DNA拷贝数应为UNDET;强阳性对照HBV DNA拷贝数应≥1×106copies/ml、临界阳性对照HBV DNA拷贝数5×103copies/ml~5×104copies/ml,标准曲线相关系数应≤-0.98,否则试验视为无效。进行YMDD变异检测,HBV YMDD弱阳性对照在FAM和VIC通道检测Ct值均应≤38,HBV YVDD血清对照、HBV YIDD血清对照在FAM通道检测所得Ct值应≤38,在VIC通道检测为UNDET,否则试验视为无效。
结果判断
根据工作曲线计算,仪器自动显示待检样品定量值,仪器显示UNDET表示待检样品为阴性。检测样品中5×102copies/ml≤HBV≤5×108copies/ml,测定结果有效,可直接报告相应的拷贝数。检测样品中HBV DNA>5×108copies/ml,即可直接报告为>5×108copies/ml,也可用正常人血清按10倍梯度做相应稀释,使其拷贝数落在1×105copies/ml~5×108copies/ml范围内再重新测定,测定结果应以稀释倍数进行校准。检测样本中HBV DNA<5×102copies/ml时,拷贝数仅供参考,报告为小于最低检测限。
待检样品在FAM和VIC通道检测Ct值≤38,判断待检样品为HBV YMDD野生型。待检样品在FAM通道检测Ct值≤38,在VIC通道检测为UNDET,判断待检样品为HBV YMDD变异型。如果检测Ct值在38~40之间,重复检测一次,如果检测Ct值仍在38~40之间,则判为阴性。
【对试验结果的解释】
乙型肝炎病毒核酸定量值反映病毒在外周血中的浓度,浓度高则传染性强。乙型肝炎病毒YMDD变异情况与该病毒对药物拉米夫定的耐药性直接有关,发生YMDD变异的病毒对拉米夫定可能存在耐药性,结合临床情况综合判断。
【该试验方法的局限性】
该试验方法仅适用于具有FAM和VIC荧光通道的荧光定量PCR分析仪,单通道荧光PCR分析仪只能进行HBV DNA定量检测,不能进行YMDD变异分析。
【产品性能指标】
产品最低检测线5×102copies/ml;线性检测范围5×102copies/ml至5×108copies/ml;经741例临床验证,产品检测HBV YMDD变异结果与核酸序列测定结果一致。
【注意事项】
开始检测前请仔细阅读本说明书全文。
1.整个检测过程应严格分在三区进行:PCR反应体系的配制区;标本处理、加样区;PCR扩增、荧光检测及结果分析区。各区使用的仪器、设备、耗材和工作服应独立专用。实验后即请清洁工作台,并进行消毒。
2.使用不含荧光物质的一次性手套(经常替换)、一次性专用离心管、自卸式移液器和带滤嘴吸头。
3.试剂准备和标本处理应使用超净工作台(负压式)或防污染罩,以防止对环境污染。
4.每次实验应设置阴阳性对照品
5.操作人员应经过专业培训,具有一定经验和操作技能。
6.操作台、移液器、离心机、PCR扩增仪等仪器设备应经常用10%次氯酸或70%酒精、紫外线灯或臭氧消毒处理。
7.实验中用过的吸头、扩增完毕的离心管、标本和其它废弃物品一同灭菌后丢弃于指定地点。
8.试剂使用前应在室温下充分融化并混匀。
9.PCR反应混合液应避

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